检测夹心法定量蛋白方法 

   测定前提的优化用棋盘测定法测定5ng/ml的rhGM-CSF/IL-3，表明hGM-CSFMcAb的浓度为10μg/ml，rhIL-3PcAb的稀释度为1:100。但目前尚无一简便有效的检测方法对rhGM-CSF/IL-3进行定量检测。100μl可以产生足够陡的剂量反应曲线，且本底低，是反应体积。为了进一步研究其在体内的药效以及药代动力，必需对其进行定量测定。综上所述，本试验建立的ELISA夹心法检测速度快、重复性好、敏捷度高、特异性好，可对样品浓度低至50pg/ml进行定量测定，几乎不受其它生物活性物质及血清成分的干扰，是对rhGM-CSF/IL-3进行有效检测的好方法。

大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-3（rhGM-CSF/IL-3）融合蛋白进行了中试纯化研究，进一步的研究表明rhGM-CSF/IL-3体外能促造血祖细胞的生长发育，具有较好的开发应用远景。基于rhGM-CSF/IL-3的免疫特性，本文建立了ELISA夹心法定量检测rhGM-CSF/IL-3。ELISA夹心法测定rhGM-CSF/IL-3融合蛋白，用250mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS pH8.0）按适当比例稀释的rhGM-CSF McAb100μl包被微孔板，20℃16h，将A液（0.1%Tween-20的PBS）洗板5次，加200μl1%BSA-PBS溶液206h，A液洗板，甩干，-20℃保留备用。当rhGM-CSF/IL-3浓度在0.49～6.25ng/ml时呈线性关系，回归系数为r=0.995，建立的方法与各种血液组份和细胞因子无交叉反应，敏捷度49pg/ml，批内变异系数为5.96%，批间变异系数为7.08%。使用时解冻，每孔加样本100μl，4℃16h;A液洗板5次，加B液（0.1%Tweem-20，0.1%BSA in50mmol/L PBS，pH7.3）适当稀释的rhIL-3PcAb100μl1h;A液洗板5次，加100μl HRP-羊抗兔IgG，37℃1h;A液洗板，加100μl OPD显色液（1mg/ml邻苯二胺，0.012%H 2 O 2 ，100mmol/L柠檬酸-磷酸缓冲液，pH5.0），30min后用2mol/L H 2 SO 4 100μl终止反应，用酶标仪检测OD 490nm 值。

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