胶体金蛋白制备操作方法
1.待标记蛋白溶液的制备 将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜,以除去多余的盐离子,然后100 000g4℃离心1h,去除聚合物。
2.待标胶体金溶液的准备 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时,调至9.0;标记McAb时,调至8.2;标记亲和层析抗体时,调至7.6;标记SPA时,调至5.9~6.2;标记ConA时,调至8.0;标记亲和素时,调至9~10。
由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板,因此,在调节pH时,采用精密pH试纸测定为宜。
3.胶体金与标记蛋白用量之比的确定
(1)根据待标记蛋白的要求,将胶体金调好pH之后,分装10管,每管1ml。
(2)将标记蛋白(以IgG为例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5mg/ml~50mg/ml,分别取1ml,加入上列金胶溶液中,混匀。对照管只加1ml稀释液。
(3)5min后,在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液,混匀后静置2h,观察结果。
(4)结果观察,对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管,均呈现出由红变蓝的聚沉现象;而加入蛋白量达到或超过zui低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的zui低蛋白质用量,即为该标记蛋白质的zui低用量,在实际工作中,可适当增加10%~20%。
4.胶体金与蛋白质(IgG)的结合 将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0,电磁搅拌IgG溶液,加入胶体金溶液,继续搅拌10min,加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5%BSA使溶液终浓度为1%;1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。
5.胶体金标记蛋白的纯化
(1)超速离心法:根据胶体金颗粒的大小,标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。
用BSA做稳定剂的胶体金-羊抗兔IgG结合物可先低速离心(20nm金胶粒用1 200r/min,5nm金胶粒用1 800r/min)20min,弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g,4℃离心1h;20nm~40nm胶体金结合物,14 000g,4℃离心1h。仔细吸出上清,沉淀物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3),将沉淀重悬为原体积的1/10,4℃保存。如在结合物内加50%甘油可贮存于-18℃保存一年以上。
为了得到颗粒均一的免疫金试剂,可将上述初步纯化的结合物再进一步用10%~30%蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。
(2)凝胶过滤法:此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋,在硅胶中脱水浓缩至原体积的1/5~1/10。再经1 500r/min离心20min。取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝胶S-400)层析柱分别纯化。层析柱为0.8 cm×20cm,加样量为床体积的1/10,以0.02Mol/L PBS液洗脱(内含0.1%BSA,0.05%NaN3,pH8.2者用IgG标记物),流速为8ml/h。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色,有时略混浊,内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物,随浓度的增加而红色逐渐加深,清亮透明,zui后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4℃保存。zui终可得到70%~80%的产量。
6.胶体金蛋白结合物的质量鉴定
(1)胶体金颗粒平均直径的测量:用支持膜的镍网(铜网也可)蘸取金标蛋白试剂,自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。
(2)胶体金溶液的OD520nm值测定:胶体金颗粒在波长510nm~550nm之间出现zui大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液(含1%BSA,0.02%NaN3)将胶体金蛋白试剂作1︰20稀释,OD520=0.25左右。一般应用液的OD520应为0.2~0.4。
(3)金标记蛋白的特异性与敏感性测定:采用微孔滤膜免疫金银染色法(MF-IGSSA)。将可溶性抗原(或抗体)吸附于载体上(滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜),用胶体金标记的抗体(或抗原)以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体,对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。
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