产品仅供研究使用，不适用于人类或临床诊断
商品属性：

产品英文名称：F-actin Staining Kit (Orange Fluorescence)

产品中文名称：F-actin染色试剂盒（橙色荧光）

规格：50 T/300 T/1000 T

货号：EY-01X8561
用途：仅供科研研究实验

特点&优势:

•  优化的实验方案，特别适用于甲醛固定与透化处理的组织切片、细胞培养物或无细胞实验中的F-actins标记，鉴定以及定量需求。

•  的鬼笔环肽染料 (橙色荧光) (Ex/Em = 593/614nm)，特异性地结合F-actins，且兼具比其它荧光素-鬼笔环肽偶联物更强的光稳定性。

保存建议:请参阅说明书中各个组分的存储条件。自发货之日起，在推荐温度下至少稳定6个月。

运输条件:蓝冰运输

背景

鬼笔环肽（phalloidin），是从一种剧毒磨菇(Amanita phalloides)中分离出来的一种多肽物质，属于毒伞肽类毒素，是一种强烈毒素。它是一种特异性结合F-肌动蛋白的双环肽，因此，使用荧光染料偶联的鬼笔环肽可以非常方便地研究F-actins的分布。在鬼笔环肽内部，半和之间存在不寻常的硫醚桥，可形成内环结构。当pH升高时，硫醚被裂解，鬼笔环肽丧失对肌动蛋白的亲和力。

本产品具有下列特点:

 1.操作简便、快捷。可直接加入到检测平板。在96-孔板中检测时,无需洗涤或收获细胞,免去溶解步骤。

2. 无放射性。不需要配制液闪混合物,也不需要处理废弃物。

3. 与MTT相比,使用更安全。不需要使用挥发性的有机溶剂来溶解甲臜产物。

4. 操作灵活,与MTT不同,平板读数后可放回温箱继续孵育,使颜色进一步生成。

操作步骤：

(一)获得目的基因

1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

(二)构建重组表达载体

1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

(三)  获得含重组表达质粒的表达菌种

1、 将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。

2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

(四)诱导表达

1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃过夜培养。

2、按1∶50比例稀释过夜菌,一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大约需3hr)。

3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。

4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀,用100μl 1%SDS重悬,混匀, 70℃10min。

5、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。

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