实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

大鼠精原分离自睾丸组织；睾丸呈微扁的卵圆形，表面光滑，覆盖着鞘膜脏层；深部是质地坚韧的白膜，在睾丸后缘增厚并进入睾丸，形成睾丸纵膈，纵膈发出许多睾丸小隔深入睾丸实质，将实质分为睾丸小叶，数量约为100～200。每个小叶内约有2～4条生精小管，具有产生精子的作用；生精小管之间的结缔组织中有睾丸间质细胞，具有产生雄激素的作用。生精小管首先汇合成为精直小管(也称直精小管)，精直小管进入睾丸纵膈形成睾丸网，之后睾丸网发出12～15条输出小管通过睾丸后上缘进入附睾。生精小管的生精上皮是精子产生的地方，由生精细胞和支持细胞构成，成人的生精小管有30～70cm长。精子的产生过程包括生精细胞的分化、支持细胞的作用、雄激素的调节等。生精细胞并不是一种细胞，它是多种细胞的统称，包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、精子。前者依次发育分化为后者，且依次从生精上皮的基部到管腔面排列，终形成精子进入到管腔之中，并借助生精上皮外侧的肌样细胞的收缩作用向下一级管腔移动。精原细胞是指由睾丸精子管上皮的原始生殖细胞经过多次有丝分裂而形成的细胞。原始的胚细胞经分化形成精原细胞，精原细胞经复制形成初级精母细胞，初级精母细胞经过减数次分裂后形成次级精母细胞，再经过减数次分裂形成精细胞。精细胞经过变形终形成精子。精原细胞属于雄性生殖细胞的早期发育阶段，能不断地进行有丝分裂，增加细胞数量，并分化为精母细胞。精原细胞贴近基膜，细胞呈圆形，核大而圆，梁色深。精原细胞在男性的一生中具有几乎无限分裂的能力，而且分裂过程中能够保持原有的基因性状不变。在增殖过程中，通过精原细胞的分裂和分化，由精原细胞产生精母细胞，进入成熟分裂，因而通过增殖可大大增加精母细胞的数量。按理论推算，一个精原细胞通过数次细胞分裂，可形成上百个初级精母细胞。但在生精过程早期，生精细胞很易发生变性，故实际上少于这个数字。在精原细胞的增殖过程中，有一部分Ad型精原细胞不再继续分裂，而是保留下来，成为新的精原干细胞，因此通过增殖不仅能使精原干细胞不断得到更新，且能使精原干细胞保持一定数量，从而使精子的产生持续地进行下去，不会枯竭。

方法简介：

实验室分离的大鼠精原采用混合酶多步消化法制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

实验室分离的大鼠精原经AP(碱性磷酸酶)免疫组化染色鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养信息：

培养基：含FBS、生长添加剂、GDNF、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：圆形、椭圆形

传代特性：可传2-3代左右

消化液：0.25%

培养条件：气相：空气，95%；CO2，5%

大鼠精原体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的佳培养状态。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和尊龙凯时联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和尊龙凯时联系，告知细胞的具体情况，以便尊龙凯时的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

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