实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

大鼠肺小动脉内皮分离自肺小动脉组织；肺动脉干是短而粗的动脉，自右心室的动脉圆锥起始，向左后上方斜升，先在升主动脉根部的前面，继而至其左侧，至主动脉弓的下方，约在第5胸椎高度，分为左、右肺动脉。左肺动脉较短，横行向左，经左主支气管前方至左肺门，分两支进入左肺的上、下叶。右肺动脉较长，横行向右，经主动脉升部和上腔静脉的后方达右肺门，分3支进入右肺上、中、下叶。左、右肺动脉的各分支在肺实质内又反复分支，与支气管的分支伴行，最后达肺泡壁，形成稠密的毛细血管网。肺动脉输送的是含二氧化碳较多的静脉血。在肺动脉干分叉处稍左侧与主动脉弓下缘之间有一结缔组织索，称动脉韧带。管径在0.3～1mm之间，为小动脉（small-artery），小动脉包括粗细不等的几级分支，也属肌性动脉。较大的小动脉，内膜有明显的内弹性膜，中膜有几层平滑肌，外膜厚度与中膜相近，一般没有外弹性膜。口径在1mm以下的动脉，管壁有完整的平滑肌层及少量的弹性纤维和胶质纤维。小动脉是决定周围循环阻力大小的主要因素，也是调节微循环灌注量的“总开关"。典型的小动脉，其管壁的厚度与管径相比约为1∶2。中膜的肌层相对比其他动脉为厚，当平滑肌在神经支配下强力收缩时，其管腔可以闭塞，而使血液不能流入它所分布的毛细血管内，从而增加了周围血液循环的阻力。如果有许多小动脉同时收缩，可使血压显著上升。反之，当小动脉的平滑肌舒张时，则可使大量的血液流入毛细血管，外周阻力明显下降，血压降低。终末小动脉(terminal arteri-ole)的口径为20～30μm；后小动脉(metar-teriole)，又称毛细血管前小动脉(precapil-lary arteriole)的口径为12～15μm。管壁内均有较稀疏的平滑肌，在毛细血管前小动脉分支的起始部分，管壁平滑肌成分增厚，叫做毛细血管前括约肌(precapillary sphinc-ter)，其收缩或舒张，可调节真毛细血管的血流量，是调节微循环灌注量的“分开关"。支配小动脉平滑肌的交感神经纤维，可延伸到终末小动脉和后小动脉的平滑肌细胞。在毛细血管前括约肌上交感神经纤维特别丰富。肺小动脉内皮细胞呈单层多角形铺路石状分布，该细胞在维持血管内外的动态平衡、合成和分泌细胞因子和介质、维持凝血和纤溶的动态平衡中起重要作用。

方法简介：

实验室分离的大鼠肺小动脉内皮采用-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法、并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

实验室分离的大鼠肺小动脉内皮经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养信息：

包被条件：PLL（0.1mg/ml），明胶（0.1%）

培养基：基础培养基，含FBS、EGF、bFGF、IGF、VEGF、Heparin、Hydrocortisone、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：内皮细胞样

传代特性：可传2-3代

消化液：0.25%

培养条件：气相：空气，95%；CO2，5%

大鼠肺小动脉内皮体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的培养状态。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和尊龙凯时联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和尊龙凯时联系，告知细胞的具体情况，以便尊龙凯时的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

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